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생 희석 ASF 백신 후보 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR에 의해 유도된 보호 지속성을 평가하는 반복적이고 지연된 상동 도전 연구
작성자
정싱화
김연지
, 최 선A.
, 이수진이
승표신
이세영
김원준
문 성철
신용우
김도순
신병철
수아 최
성 지윤
가람 김
원화종
정향수
1
중앙연구개발원, 코미팜 인터내셔널 주식회사, 시흥시 15094, 대한민국
2
야생동물질병대응팀, 국립야생동물질병통제연구소(NIWDC), 기후에너지환경부(MCEE), 광산구 송감길 1지, 광주, 62407, 대한민국
*
서신을 주고받아야 할 저자들.
†
이 저자들도 이 작업에 동등하게 기여했다.
제출 접수일: 2026년 5월 12일 /
개정: 2026년 6월 21일 /
승인: 2026년 6월 23일 /
발행일: 2026년 6월 25일
초록
배경/목적: 아프리카 돼지열병(ASF)은 집돼지와 야생 수이드에 감염되는 매우 치명적인 질병으로, 전 세계적으로 상당한 경제적 손실을 계속 초래하고 있습니다. 최근 생체 감쇠 ASF 백신 개발이 진전되었음에도 불구하고, 풍토병 환경을 대표하는 반복 노출 조건에서 지속 가능한 보호를 입증하는 증거는 여전히 제한적입니다. 여기서는 ASF 풍토병 지역에서의 재노출을 모델링하는 반복 도전 실험 설계를 사용하여 생체 감쇠 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신의 장기 안전성과 보호 효과를 평가하였습니다. 방법: 백신 접종 후 8주 및 12주에 반복 도전(3회 연속 접종)과 단일 도전 등 여러 간격으로 동성 독성 ASF 바이러스 도전을 받았습니다. 결과: 모든 도전 요법에서 백신 접종을 받은 동물들은 생존하여 임상적으로 건강을 유지했으며, 세 가지 도전 공격을 받은 동물도 반복적인 노출 압력 하에서도 지속적인 보호를 지원했습니다. 백신 접종 후 8주 또는 12주에 도전 대상이 된 동물들도 완전 생존을 보였으며, 최소 12주 동안 효능이 유지되었음을 나타냈다. 연구 기간 동안 백신 관련 부작용 임상 결과는 발견되지 않았으며, 도전 후 바이러스 배출도 최소한이었습니다. 결론: 전반적으로 이 데이터는 후보 생체 감쇠 ASF 백신이 우수한 보호 효과를 제공하며 상동 ASF 바이러스 감염에 대해 지속적인 보호를 제공함을 보여줍니다. 이 결과는 불안정한 ASF 생물보안이 있는 지역에서 반복 노출 조건에서도 동일하게 적용 가능할 것으로 기대되며, ASF 유행 지역에서의 현장 적용에 충분히 유망한 모델 실험이 될 것입니다. 하지만 여전히 백신 변이이며, 유전체 안정성과 전염성을 평가하기 위한 추가 연구가 계획되어 있습니다.
1. 서론
아프리카 돼지열병(ASF)은 아프리카 돼지열병(ASFV)에 의해 발생하며, 집멧돼지와 멧돼지에게 영향을 미치는 치명적이고 종종 치명적인 출혈성 질병입니다. ASFV는
Asfarviridae과에 속하는 대형 이중 가닥 DNA 바이러스입니다 [
1]. 1920년대 케냐에서 처음 발견된 ASF는 이후 전 세계로 확산되어 높은 사망률, 무역 제한, 개체수 감소 조치로 인해 돼지 산업에 큰 경제적 손실을 초래했습니다 [
2,3].
사하라 사막 이남 아프리카, 유럽 일부 지역, 아시아 등 풍토병 지역에서는 야생 수이드, 진드기(
Ornithodoros spp.), 집안 돼지를 포함한 복잡한 전파 주기를 거치며 효과적인 예방접종 없이는 통제가 어렵습니다 [
4,5,6,7]
.
기존 방제 전략, 즉 생물보안 조치와 도태 조치는 특히 지속적인 바이러스 유산 지역에서 발병을 예방하기에 충분하지 않음이 입증되었지만, 일부 지역에서는 뒷마당 농장의 만연으로 인해 ASF 방제가 더욱 복잡해졌습니다 [
8,9,10].
안전하고 효과적인 백신 개발이 최우선 과제로 떠올랐으며, 생백신(LAVs)은 자연 감염을 모방한 강력한 세포 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 능력 덕분에 유망한 후보로 떠올랐습니다 [
5,11].
최근 개발된 LAV 균주 중 ASFV-G-ΔI177L은 ASF 백신 개발에 있어 중요한 이정표를 의미했습니다. I177L 유전자(MGF505-7R)의 결실을 통해 개발된 ASFV-G-ΔI177L은 상동 도전에 대해 강한 보호 효과를 보였으며 백신 후보로서의 초기 가능성을 보였습니다 [12,13,14
].
그러나 이 균주는 1차 돼지 폐포 대식세포 내 복제에 제한되어 상업적 생산 가능성을 심각하게 제한했습니다. 더불어, 최근 연구들은 ASFV-G-ΔI177L의 유전적 불안정성을 밝혀내었으며, 실험 연구와 백신 접종 시험 모두에서 병원성으로 되돌아가는 사례가 문서화되었습니다 [
15]. 추가적인 안전 우려로는 멧돼지 정액을 통한 백신 바이러스 배출이 생식성 전파 위험 증가 [
16]. 유전적 안정성에 대한 우려는 현장 환경에서도 문서화되었는데, 최근 베트남 연구에서는 백신 접종되지 않은 돼지 농장에서 독성이 강한 ASFV-G-ΔI177L 유래 변이가 발견되었다고 보고되었습니다 [
17]. 전반적으로 이 결과는 백신 안전성과 유전적 안정성을 높이기 위해 다중 유전체 결손을 포함하는 ASFV 생체 감쇠 백신의 감쇠 전략 개선 필요성을 강조합니다.
상업적 생산 한계를 극복하면서도 백신의 효능과 안전성을 유지하기 위해, ASFV-G-ΔI177L은 안정적인 플럼 아일랜드 돼지 상피세포(PIPEC)에서 연속 배선을 통해 효율적으로 전파되도록 개조되어 파생 균주인 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR이 개발되었습니다 [
18]. 이 새로운 변주는 모체 ASFV-G-ΔI177L과 동등한 수준의 감쇠, 면역원성, 보호 효능을 유지하면서도 기존 세포 배양 시스템에서 확장 가능한 백신 생산을 가능하게 했습니다. 적응 과정은 좌측 변광 영역(LVR)에서 자연적으로 발생하는 10,842 bp 결실을 포함하며, 여러 MGF360 및 MGF300 계열 유전자와
X69R 유전자를 제거했습니다 [
18].
LVR 결실의 과학적 근거는 ASFV가 기존 세포주에 적응하는 잘 알려진 관찰에서 비롯됩니다. LVR 결실은 ASFV 세포 배양 적응 과정에서 흔히 관찰되며, 특히 MGF505와 MGF360 등 다유전자 계열(MGF) 구성 요소에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다 [
19]. 이 유전체 변화는 인위적으로 도입된 것이 아니라 PIPEC 환경에서 효율적인 바이러스 복제를 가능하게 하는 필수적인 적응을 나타냅니다. LVR 결실은 1차 대식세포 외부에서 성장을 제한하는 유전자를 제거함으로써 세포 트로피즈의 변화에 기여할 가능성이 높으며, 이를 통해 상업적 생산을 용이하게 하면서 백신의 고유한 안전성과 보호 특성을 유지할 수 있습니다. 이러한 자연적 적응은 부모 균주의 실용적 적용을 제한했던 중요한 생산 병목 현상을 해소하여 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR을 상업용 백신 개발의 더 실현 가능한 후보로 자리매김하게 합니다 [
18].
이 LAVs는 야생형 상동 바이러스 및 현재 동남아시아 및 동북아시아 지역에서 유통 중인 현장 분리주에 의한 도전 감염 후 임상 질환 예방에 높은 효능을 보였습니다 [
13,20,21].
그러나 특히 반복적인 바이러스 감염을 시뮬레이션하는 풍토병 노출 조건에서 장기적 효능에 대한 이해에는 여전히 부족함이 남아 있습니다. 이는 시간이 지남에 따른 여러 감염의 실제 상황을 반영합니다. 이러한 감쇠된 백신 균주에 대한 면역학적 상관관계는 완전히 밝혀지지 않았으나, ASF 감쇠 생백신 접종 후 말초혈 단핵세포 수치, 인터페론(IFN γ) 생성 세포 수, 다양한 인터루킨(IL)과 강한 지속성 백신 항체 수치를 연관시키는 연구가 보고되었습니다 [
22,23,24].
따라서 본 연구는 반복적인 상동 바이러스 도전 실험과 백신 접종 후 8주 및 12주 시점의 지연 도전 프로토콜을 포함한 포괄적인 실험 설계를 활용하여 돼지에서 백신 효능과 ASF 보호 항체의 지속성을 평가하였습니다. 더불어, 이 임상시험에는 면역 반응과의 상관관계를 예측하기 위한 혈청 사이토카인 분석이 포함되었으나, 실험적 범위는 제한적이었으나 살아있는 약화 ASF 백신의 성능을 포괄적으로 평가할 수 있었습니다. 한 가지 발견은 혈액에서 백신 게놈이 지속적으로 검출되었고, 단일 백신 접종 후 대부분의 개인에서 높은 백신 항체 농도가 유지되었다는 점입니다. 그러나 일부 사람들은 혈액 내 백신 유전체가 낮거나 완전히 사라졌음에도 불구하고 4개월 동안 높은 수준의 백신 항체를 유지했습니다. 따라서 이 현상과 세포 면역 표지 간의 상관관계를 이해하기 위해 관련 IFN-γ, IL-12/IL-23 p40, 항염증 사이토카인 표지자 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1ra)를 비교 및 분석하였습니다.
실험 설계에는 백신 항체 형성 후 최대 3회량까지 반복적으로 도전 감염을 시행하는 것과 백신 접종 후 지속 면역원성을 평가하는 지연 도전 프로토콜이 포함되었습니다. 이 프로토콜은 전염병 상황을 모방하는 조건에서 누적 바이러스 압력에 대한 내구성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 결과는 모든 실험 동물이 완전한 보호를 보였고, 모든 그룹에서 임상 질환이 없음을 보여주어 백신의 안전성과 지속적인 보호 효과가 확인되었습니다. 모든 백신 접종 동물이 도전 감염에서 살아남았지만, 표본 크기가 적어 통계적 추론이 제한됩니다. 이러한 발견은 초기 보호 효과를 입증한 이전 연구들[14,18,25,26
]를 바
탕으로 장기 및 다중 노출 시나리오로 보호를 확장하여 ASF 풍토병 지역에서의 현장 시험의 토대를 마련합니다.
따라서 이러한 유형의 임상 시험은 실현 가능한 현장 임상 시험 모델로 간주됩니다. 특히 ASF가 지속적이고 주기적으로 발생하는 특정 아시아 지역과 다양한 규모의 뒷마당 농장이 존재하는 특정 아시아 지역에서 백신 정책 효과를 전략적으로 평가하는 데 귀중한 데이터를 제공할 것으로 기대됩니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 세포 배양과 바이러스
살아 약화된 ASFV 백신 후보인 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR의 준비 및 특성 분석은 세계동물보건기구(WOAH) 지침에 따라 앞서 자세히 설명한 대로 진행되었다 [
15]. 간단히 말해, 백신 균주는 USDA가 제공한 8번째 통과(P8) ASF-LAV에서 유래했으며, 이후 소 αVβ6 인테그린을 안정적으로 발현하는 플럼 아일랜드 돼지 상피세포(PIPECs)를 추가로 유래시켰다. 세포는 표준 배양 조건에서 유지되었으며, 바이러스 복제는 mCherry 형광으로 모니터링되었다[
18]. 연속 유전자 배지 후, 가장 높은 역가와 확인된 유전적 안정성을 가진 P19 바이러스 군주가 주 씨앗 바이러스로 선정되었다.
바이러스 적정은 1차 돼지 대식세포 배양을 사용하여 수행되었으며, 감염성 역가는 흡수 분석법으로 결정되고 리드 및 뮌치 방법으로 계산되었다 [
27]. 가축 돼지들은 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신으로 면역을 받았고, 이후 상동종의 고병원성 현장 균주인 Korea/wildboar/ASFV-Hwacheon/2020(GenBank 등록번호 OR159219.1)으로 도전 검사를 받았다. 실험적 도전 요법에는 장기적인 안전성과 보호 지속성을 평가하기 위한 반복 및 지연 상동 접종이 포함되었다.
2.2. 동물 실험
동물 실험은 환경부 산하 국립야생동물질병통제예방연구소(NIWDC) 야생동물질병대응팀에서 동물 생물안전 레벨 3(ABSL-3) 조건 하에 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 NIWDC-IACUC-2025-002)에서 승인되었습니다. 실험 동물은 8주 된 상업용 품종 돼지였습니다. 시설에 도착한 후 최소 1주간의 적응 기간을 거쳐 실험에 영향을 줄 수 있는 주요 돼지 질병이 없음을 관찰했습니다. 적응 기간 동안 혈액 샘플을 채취하여 돼지 서코바이러스 2, 마이코플라즈마 하프네우모니아, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스의 감염 상태를 확인했습니다. 동물들은 근육 내 백신 접종을 위해 세 가지 뚜렷한 시험 모델(T-1, T-2, T-3)으로 나뉘었고, 각 모델에는 도전 대조군(C-1, C-2, C-3)이 배정되었습니다. 각 시험 모델에는 도전 예방접종을 위해 4마리의 돼지가, 각 모델 내의 도전 대조군에는 2마리의 돼지가 배정되었습니다. 간단히 말해, 모든 동물은 동일한 백신 접종을 받았으나 서로 다른 시점에 도전 대상이 되었습니다. T-1 그룹은 4주, 8주, 12주에 반복적인 도전 감염을 받았고; T-2 그룹은 8주에 단일 도전 감염을, T-3 그룹은 12주에 단일 도전 감염을 받았습니다(
표 1). 본 연구는 표본 크기가 적다는 점을 인정하지만, 후보 백신의 효능을 확정적으로 입증하기보다는 추가 연구를 뒷받침하기 위한 예비 증거로 제시합니다. 더불어, 현재 국제 기준에 따른 검증이 필요한 예비 연구로서, WOAH 기준을 준수하는 대규모 확인 임상시험의 실현 가능성을 뒷받침하는 개념 증명 데이터를 제공하는 것을 목표로 합니다 [
10].
실험군은 세 가지 시험 모델로 나뉘어 10시에 ASFV-G-∆I177L/∆LVR 1mL를 근육 주사로 접종했습니다
3
TCID
50
같은 날에. 도전 바이러스는 매우 병원성이 높은 한국산 현장 변종인 화천/2020에서 10일에 준비되었습니다
2
가졌다
50
각 실험 모델에서 근육 내 접종을 위한 것입니다. 백신 접종 후에는 각 시험 모델별로 임상적 징후와 직장 온도를 매일 측정하였습니다. 모든 샘플은 ASF 챌린지 간격별로 백신 항체, 백신 게놈, 혈청 사이토카인 분석을 위한 참조 물질로 사용되었습니다. 각 모델마다 실험 기간이 끝날 때 동물들이 안락사되고 부검되었습니다.
(i)
-
T-1 그룹(V1–V4): 4마리의 건강한 8주 된 돼지를 실험 동물로 사용했습니다. 전혈, 구강, 직장 면봉 샘플은 접종 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일, 28일에 채취되었습니다. 이 샘플들은 백신 게놈 복제 번호, 항체 및 사이토카인 분석에 사용되었습니다. 주요 도전은 백신 접종 후 28일째에 진행되었습니다. 동일한 목적을 위해 샘플은 도전 후 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일, 28일에 채취되었습니다. 두 번째 도전은 첫 번째 도전 후 28일 후에 진행되었습니다. 두 번째 도전 후 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 dpc에서 샘플을 수집했습니다. 마지막 3번째 도전은 두 번째 도전 후 24일째에 진행되었습니다. 세 번째 도전 이후, 3일, 7일, 11일, 14일, 18일, 21일째에 샘플을 채취한 후 동물들은 안락사되었습니다. 안락사된 동물들은 병리 분석을 위해 부검되었다.
(ii)
-
T-2 그룹(V5–V8): 4마리의 건강한 8주 된 돼지를 실험동물로 사용했습니다. 전혈, 구강, 직장 면봉 샘플은 T-1 그룹과 백신 접종 후 동일한 시점에 채취되었습니다. 도전 검사는 59 DPV로 수행되었으며, 임상 증상은 101일째까지 모니터링되었습니다. 모든 샘플은 T-1 그룹에 적용된 것과 동일한 절차를 사용해 분석되었습니다.
(iii)
-
T-3 그룹 (V9–V12): 건강한 8주 된 돼지 4마리를 실험 동물로 사용했습니다. 전혈, 구강, 직장 면봉 샘플은 T-1 그룹과 백신 접종 후 동일한 시점에 채취되었습니다. 도전 검사는 87 DPV에서 수행되었으며, 임상 증상은 101일째까지 관찰되었습니다. 모든 샘플은 T-1 그룹에 적용된 것과 동일한 절차를 사용해 분석되었습니다.
(iv)
-
양성 통제군: 세 개의 양성 통제군(C–13~C14, C–15~C16, C–17~C18)에 각 시험 모델당 두 개의 도전 대조군이 배정되었습니다. 각 시험 모델에서 도전 접종과 동시에 대조군에 도전 접종이 시행되었으며, 양성 대조군으로 사용되었습니다. 또한 각 시험 모델마다 동시에 샘플 채취가 이루어져 사망 시점까지 모든 샘플을 수집하고 부검을 수행했습니다.
2.3. ASFV 게놈 검출을 위한 정량적 실시간 PCR(qPCR)
qPCR은 각 실험 모델에서 전혈, 구강 면봉, 직장 면봉 샘플에서 ASFV DNA를 검출하는 데 사용되었습니다. 실험 절차는 이전에 설명한 방법[15,24]에 따라 수행되었으며, 약간의 수정이 있었습니다. 간단히 말해, 각 백신 접종과 도전 후 시점에 전혈, 구강 면봉, 직장 면봉 샘플을 채취했습니다. ASFV DNA는 RSC 전혈 DNA 키트와 RSC 조직 DNA 키트(Maxwell; 미국 매디슨의 Promega)에서 제조사의 지침을 따라 Maxwell CSC 48 계측기 IVD(Promega)를 사용했습니다. DNA 추출 절차는 모든 샘플 유형에 동일했습니다.
®
®
각 샘플마다 300 μL 전혈 또는 면봉 부유액액을 반응관에 옮긴 후, 20 μL 단백질효소 K와 200 μL 용해 완충제가 추가되었습니다. 샘플은 10초간 소용돌이로 돌리고, 가열 블록을 사용해 56°C에서 20분간 배양했습니다. 이후 제조사 프로토콜에 따라 DNA 정제가 수행되었고, 핵산은 50 μL 용출 버퍼에서 용출되었습니다.
ASFV 특이 qPCR은 VetMAX™ 아프리카 돼지열병 바이러스 검출 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 수행되었으며, 이 키트는 p72 유전자를 표적으로 하는 ASFV 검출에 대해 WOAH에서 검증 및 인증받았습니다 [
25]. 사이클 임계값(Ct) 값이 45< 샘플은 양성으로 간주되었습니다.
2.4. ASFV 항체 검출
ASFV-G-∆I177L/∆LVR 백신을 접종한 동물에서 전혈 샘플을 채취하여 이후 도전 검사를 받았습니다. 혈청은 원심분리로 분리되어 분석될 때까지 보관되었다. 혈청 내 ASFV 특이 항체 수치는 ID Screen 아프리카 돼지열병 경쟁 효소 연관 면역흡착 검사법(cELISA; IDvet, 프랑스 그라벨스), 제조사의 지침에 따라 작성되었습니다.
®
샘플 대 음성 대조군 비율(S/N%)은 제조사에서 제공한 공식을 사용하여 계산되었습니다. S/N% ≤ 40%인 혈청 샘플은 ASFV 특이적 항체에서 양성으로 간주되었습니다. S/N%가 50%≥ 샘플은 의심 물질로 분류되어 결과를 확인하기 위해 재분석되었습니다.
2.5. 혈청 사이토카인 분석
돼지 사이토카인 농도는 제조사 지침에 따라 DuoSet™ ELISA 개발 시스템을 사용하여 돼지 IFN-γ(Cat#: DY985), 돼지 IL-1ra/IL-1F3 (Cat#: DY780), 그리고 돼지 IL-12/IL-23 p40 (Cat#: DY912)(R&D 시스템, 미네소타주 미니애폴리스, 미국)를 사용하여 측정되었습니다. 고결합 96웰 마이크로플레이트(SPL 라이프 사이언스, SPL38096, 경도, 대한민국 SPL38096)는 상온(RT)에서 포획 항체로 하룻밤 코팅하고, 세척한 후 인산염 완충 생리식염수에서 1% 소 혈청 알부민으로 1시간 동안 차단하였습니다. 그 후 표준 검사와 샘플을 추가한 후, 비오티닐화 검출 항체와 스트렙타비딘-고추냉이 과산화효소로 순차적으로 배열하였습니다. 색상은 1-Step™ Ultra TMB-ELISA 기질(Thermo Scientific, 34028, Waltham, MA, USA)을 사용하여 개발되었으며, 반응은 스톱 솔루션(Invitrogen, SS04, Waltham, MA, USA)으로 중단되었습니다. 흡광도는 450 nm에서 측정되었고, 기준 보정은 540 nm에서 Epoch 2 마이크로플레이트 리더기(BioTek, Santa Clara, CA, USA)를 사용했으며, 보정값(OD450–OD540)을 분석에 사용했습니다. 사이토카인 농도는 각 분석법마다 연속 희석 표준으로 생성된 표준 곡선을 통해 계산되었습니다.
3. 결과
3.1. 실험 모델에서 다중 및 지연 도전에 대한 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신의 보호 효과
시험군은 세 개의 하위 그룹으로 나뉘었습니다. 첫 번째 그룹(T-1)은 매우 독성이 강한 필드 ASFV 균주 화천/2020을 사용하여 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR에 대한 보호 면역의 내구성을 평가하기 위해 세 차례 반복 도전 접종을 받았습니다. 나머지 그룹(T-2와 T-3)은 10명으로 도전받았습니다
2
각 실험 모델별로 ASFV-ΔI177L/ΔLVR 백신의 보호 능력을 백신 접종 후 8주 및 12주 시점에 확인하기 위해 병원성 필드 ASFV-화천/2020을 측정했습니다. 동시에 각 그룹당 양성 대조군 2마리를 도전 시점에 병원성 필드 ASFV-화천/2020에 도전 검사하고 백신 그룹과 비교하여 평가하였다. 양성 대조군 6개 동물은 독성 필드인 ASFV-화천/2020만 투여받았으며, 감염 후 5일에서 6일째(pi)에 체온이 40°C를 넘었고, 거식증, 우울증, 청색증, 비틀거리는 보행, 설사 등 질병 관련 임상 증상을 보였다(그림 1a). 증상은 시간이 지남에 따라 점차 악화되었고, 8일째에서 12일째 주기에는 극심한 고통으로 인해 동물들이 죽거나 안락사되었습니다. 반면, 세 가지 서로 다른 임상시험 모델에서 백신 접종 후 도전받은 동물들은 시장 연령까지 건강한 상태를 유지했으며, 발열 반응이나 특정 임상 소견이 없었습니다. 접종 모델별 상세 결과는 다음과 같습니다.
그림 1. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR/10을 근육 내 접종한 돼지의 직장 온도 역학
3
TCID
50
그리고 ASFV-화천/2020 (G-II)/10과의 도전 이후
2
가졌다
50
. 점선은 40°C에서 열이 발생하는 임계값을 나타냅니다. 각 곡선은 각 그룹에서 개체 동물의 가치를 나타냅니다. 대조군 동물의 데이터는 빨간색으로 표시되어 있습니다. (a) 트리플 챌린지; (b) 8주차 챌린지; (c) 12주차 챌린지.
T-1 그룹(V1–V4): 8주 된 돼지 4마리가 처음에 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 접종받았습니다. 40°C에서의 일시적 열성 반응이 두 동물에서 관찰되었으나, 백신 접종 후 28일째까지 특정한 임상 증상은 발견되지 않고 자연적으로 해결되었습니다. 백신 접종 후 28일째, 첫 번째 도전 검사는 10mL 1ml를 사용하는 근육 주사(IM)로 투여되었습니다
2
HAD 전역 ASFV-화천/2020. 28일간의 관찰 기간 동안 특정한 열성 반응은 관찰되지 않았으며, 모든 동물은 두 번째 도전 이전에는 ASF 관련 증상 없이 임상적으로 정상을 유지하였습니다. 두 번째 도전은 첫 번째 도전 후 28일째에 수행되었으며, 모니터링 기간 동안 열성 반응을 포함한 구체적인 임상 소견은 관찰되지 않았습니다. 마지막 세 번째 도전은 두 번째 도전 후 28일째에 수행되어 18일간 모니터링되었으며, 이 기간 동안 모든 동물은 정상적이고 격렬한 먹이 행동을 보이며 건강한 상태를 유지했습니다. 세 번의 연속 도전 후 네 동물 모두 부검을 실시한 후, 주요 장기 정밀 검사 결과 대부분의 장기에서 ASF 병변이 검출되지 않았습니다. 그러나 네 마리 동물 모두 위간림프절에서 경미한 울혈과 출혈이 관찰되었습니다.
양성 대조군(C-13, C-14): 양성 대조군 2마리를 양성 대조군으로 삼아 10mL 1mg을 근육 주사로 접종했습니다
2
첫 번째 도전 당시 같은 방법으로 ASFV-화천/2020에서 독성 전파를 일으켰습니다. 도전 후 4일째부터 6일간 40°C를 초과하는 고열이 지속되었습니다(그림 1a). 한 마리는 도전 후 10일째에, 다른 한 마리는 도전 후 13일째에 죽었습니다. 부검 결과 대부분의 주요 장기, 특히 하악하림프절과 위간림프절에 심한 비대와 울혈/출혈이 발견되었으며, 신장에서는 비장대 및 점상 출혈이 발견되어 전형적인 ASF 부검 소견을 보였다.
T-2 그룹(V5–V8): 8주 된 돼지 4마리가 처음에 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 접종받았습니다. 백신 접종 후 28일째까지 두 동물에서 일과성 열이 관찰되었으나, 특정 임상 증상은 발견되지 않았습니다(그림 1b). 백신 접종 후 59일 후, 첫 번째 도전 검사는 10mL 단위의 근육 주사를 투여했습니다
2
2020년 ASFV-화천 전소 감염. 약 46일간의 관찰 기간 동안 동물들은 ASF 관련 증상을 보이지 않았으며 임상적으로 정상 건강 상태를 유지하였다. 그룹의 네 마리 동물 모두 46일째에 부검을 위해 안락사되었다. 주요 장기 정밀 검사 결과 대부분 장기에서 ASF 병변이 검출되지 않았다. 그러나 T-1 그룹과 유사하게, 위간림프절에서 경미한 울혈과 출혈이 관찰되었다.
양성 대조군(C-15, C-16): 양성 대조군 2마리를 양성 대조군으로 삼아 10mL 1mg을 근육 주사로 접종하였다
2
T-2 그룹의 첫 도전 시점에 동일한 방법으로 독성 현장 ASFV-화천/2020. 도전 후 4일째부터 5일간 40°C를 초과하는 고열이 지속되었다(그림 1b). 한 마리는 9일차에, 다른 한 마리는 도전 후 10일째에 사망했다. 사망 후 부검 검사에서 대부분의 주요 장기에서 전형적인 ASF 부검 소견이 확인되었다.
T-3 그룹(V9–V12): 8주 된 돼지 4마리가 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 처음 접종했습니다. 백신 접종 후 28일째까지 일시적인 열이 관찰되었으나, 특정 임상 증상은 발견되지 않았습니다(그림 1c). 접종 후 87일 후, 첫 번째 도전 검사는 10mL 단위 명맥근육 주사로 투여되었습니다
2
2020년 야외 ASFV-화천에서 독성이 강한 동물이 있었습니다. 18일간의 관찰 기간 동안 동물들은 ASF 관련 증상을 보이지 않았고 임상적으로 정상적인 건강 상태를 유지했습니다. 따라서 ASF 백신의 면역원성은 접종 후 약 3개월이 지난 매우 늦은 시점까지 지속되었으며, 고병원성 현장 분리 ASFV에 대해서도 보호 효과가 입증되었습니다. 이 그룹의 네 마리 동물은 도전 후 18일째에 부검을 위해 안락사되었습니다. 주요 장기 정밀 검사 결과 대부분의 장기에서 ASF 병변이 발견되지 않았습니다. 그러나 T-1 및 T-2 그룹과 마찬가지로 위간림프절에서 경미한 울혈과 출혈이 관찰되었습니다.
양성 대조군(C-17, C-18): 두 마리의 돼지가 양성 대조군으로 활동하며 10mL 1mg을 근육 주사로 접종했습니다
2
T-3 그룹의 첫 도전 시점에 동일한 방법으로 병원성 필드 ASFV-화천/2020. 도전 후 4일째부터 5–10일간 40°C를 초과하는 고열이 지속되었다(그림 1c). 한 마리는 도전 후 10일차에, 다른 한 마리는 12일째에 사망했다. 사망 후 부검 검사 결과 대부분의 주요 장기에서 전형적인 ASF 부검 소견이 나타났다.
3.2. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 도전 돼지에서 ASF 백신 항체 평가
cELISA를 이용한 항체 검출은 S/N% 값이 <40%일 때 양성으로 해석되었습니다. 백신 접종 후 각 그룹에서 계획된 시점에 전혈 샘플을 채취하여 백신에 대한 항체 반응을 평가하였습니다(
그림 2,
그림 3,
그림 4 및
표 2,
표 3,
표 4).
그림 2. 이 그래프는 백신 접종 후 4주 간격으로 세 번의 도전 검사를 받은 후 모든 간격에서 경쟁 효소 결합 면역흡착 분석법(cELISA)으로 측정된 백신 항체 역가를 보여줍니다. 양성 임계치(S/N% ≤ 40)를 충족하는 항체가 접종 후 7일째부터 검출되었고, 이후 도전 시점마다 백신 항체 수치가 더 높게 유지되었습니다.
Figure 3. This graph shows challenge results at 8 weeks post-vaccination and vaccine antibody levels measured by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (cELISA). Antibodies meeting the positive threshold (S/N% ≤ 40) were detected starting 7 days post-vaccination. Higher vaccine antibody levels were maintained over time, and even higher antibody levels were confirmed at 8 weeks post-challenge.
그림 4. 이 그래프는 백신 접종 후 12주 시점의 도전 결과를 보여주며, 경쟁 효소 연관 면역흡착 분석법(cELISA)을 통해 백신 항체 역가를 측정한 결과입니다. 항체 양성(S/N% ≤ 40)은 백신 접종 7일째부터 확인되었습니다. 시간이 지남에 따라 더 높은 백신 항체가 유지되었고, 도전 후 12주에 더 높은 항체 역가는 확인되었습니다.
T-1군(V1–V4): ASFV-G-∆I177L/∆LVR 접종군에서는 접종 후 7일째에 4명 중 1명(25%, 1/4)에서 항체 양성 반응이 검출되었습니다. 10일째부터 모든 접종 동물에서 중간 정도의 양성 항체 반응(S/N% = 21.48 ± 6.75)이 확인되었습니다. 28 dpv에서는 상대적으로 높은 수준의 양성 항체 반응(S/N% = 19.88 ± 1.72)이 지속되었습니다. 첫 번째 도전 이후에는 더 높은 항체 수치(S/N% = 9.58 ± 3.12)가 유지되었습니다. 두 번째와 세 번째 도전 시점의 항체 농도는 점차 높아졌으며, 이는 안락사 때까지 유지되었습니다. 반면, ASF 양성 대조군(C13–C14)은 백신 접종을 받지 않았고, T-1 그룹의 첫 번째 도전 28 dpv와 동시에 도전 대상을 맞았습니다. 따라서 도전 후 7일째부터 대조군에서 현장 분리된 ASFV에 대한 항체가 검출되기 시작했으나, 모든 동물은 14일째에 사망했습니다(
그림 2 및
표 2).
T-2군(V5–V8): 백신 접종 후 7일째에 4명 중 1명(25%, 1/4)에서 양성 항체 반응이 검출되었습니다. 10일째부터 모든 백신 접종 동물은 중간 정도 양성 항체 반응으로 혈청전환을 보였으며, 백신 항체 수치는 시간이 지남에 따라 급격히 증가하여 도전 시점(59일차)에서 S/N% = 6.98 ± 3.81에 도달했습니다. 59일째 도전 후에도 ASF 항체 수치가 더 높게 관찰되었는데(S/N% = 2.28 ± 2.92),
T-3 그룹 (V9–V12): 백신 접종 7일째에 4마리 중 1마리에서 양성 항체가 검출되었으나, 17일째 DPV에서 양성 반응을 보인 동물 4명 중 3마리만 양성 반응을 보였습니다. 특히, 이 그룹의 V-12는 혈청전환이 비교적 지연되어 21일째 DPV에 양성 반응을 보였습니다. 결과적으로 백신 항체 수치는 시간이 지나도 높은 수준으로 유지되었으며, 도전 시점(87일)에도 강력한 ASF 보호 항체(S/N% = 2.60 ± 2.45)가 지속되었습니다. 87일째 챌린지 검사 후 ASF 항체 수치가 더 높게 확인되었으며(S/N% = 1.13 ± 2.25) 특히, T-3 그룹은 초기 수준 이상의 ASF 항체 수치가 지속되었으나 항체 반감기가 나타나지 않았으며, 백신 접종 후 3개월이 지난 후에도 도전 반응 전까지 백신 항체 지속성을 유지했습니다(
그림 4 및
표 4).
3.3. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 다중 및 지연 도전에 대한 비레혈증 평가
백신 관련 바이러스혈증 평가
ASFV-G-∆I177L/∆LVR 백신 접종 후 백신 관련 바이러스증은 계획된 프로토콜에 따라 전혈, 혈청, 구강 및 직장 면봉을 사용하여 평가하였습니다. 백신 게놈(ASFV p72 유전자)의 평가는 ASF 유전자를 표적으로 하는 실시간 PCR 반응에서 얻은 Ct 값을 기반으로 수행되었습니다. 전체 실험 기간 동안 전혈과 혈청의 비교 분석이 수행되었다. 시험 그룹별 전혈 Ct 값에 대한 자세한 내용은
보충 표를 참조하십시오. 각 시험군의 혈청, 구강 및 직장 Ct 값은
보충 도표와 표에 그래픽 및 표 형식으로 요약되어 있습니다.
T-1군(V1–V4): 접종 후 28일째 DPV에서 전혈 Ct 수치는 평균 25.18 ± 3.39로 측정되었습니다. 첫 번째 도전 과제가 28 dpv에서 끝난 후 31 dpc에서 Ct는 29.64 ± 3.79였고, 두 번째 도전 종료 시 Ct 가치는 36.75 ± 3.33이었습니다. 이후 세 번째 도전(안락사 시) 이후, 4마리 중 3마리의 동물이 ASF 표적 유전자에 대해 음성이었고, 단 한 마리만이 양성 반응을 보였습니다. 평균 Ct는 43.48 ± 2.63으로, 매우 낮은 비레혈증 수준을 나타냅니다(
그림 5a 및
표 S1). 혈청 내 백신 관련 바이러스혈증을 비교했을 때, 첫 번째 도전 종료 시 Ct값은 37.45± 5.38이었으며, ASF 표적 유전자는 두 번째와 세 번째 도전 종료 시 검출되지 않았습니다. 이 결과는 전혈이 혈청보다 백신 접종 후 평가에서 더 정확한 바이러스혈증 검출을 제공함을 보여주었습니다(
그림 5b 및
표 S2). 구강 면봉 분석과 관련해, 백신 관련 바이러스혈증(바이러스 배출)은 첫 번째 도전 후 대부분의 동물에서 전혈 Ct 수치에 비해 훨씬 낮은 수치(44.32 ± 1.92)로 확인되었으며, 세 번째 도전 후에는 바이러스 배출이 검출되지 않았습니다(
그림 S1 및
표 S3). 첫 번째 도전 후 직장 면봉 검사에서는 유의미하게 낮은 수치가 나타났으나, 두 번째 도전 이후로는 바이러스 배출이 검출되지 않았습니다(
그림 S2 및
표 S4).
그림 5. (a) 이 그래프는 백신 접종 후 4주 동안 세 번의 반복 도전 후 전혈에서 백신 관련 바이러스혈증을 보여줍니다. 양성 검출 기준은 사이클 임계값(Ct) ≤ 45였습니다. 이후 각 도전 과제를 거듭할 때, 안락사 시점에 백신 관련 바이러스증이 세 마리 동물 모두에서 음성으로 확인되었습니다. (b) 이 그래프는 백신 접종 후 4주 동안 세 번의 반복 도전 후 간격으로 채취한 혈청 샘플에서 관찰된 백신 관련 바이러스혈증을 보여줍니다. 양성 검출 기준은 Ct ≤ 45였습니다. 이 도전 과제가 세 번 반복되었음에도 불구하고, 안락사 8주 전부터 모든 동물에서 백신 관련 바이러스증이 검출 불가능한 수준임이 확인되었습니다.
T-2 그룹 (V5–V8): 59 dpv(첫 도전 시점)에서 평균 Ct값은 30.19 ± 1.84였고, 안락사(46 dpc) 시 Ct값은 39.02 ± 0.45였다(
그림 6a 및
표 S5). 반면, 첫 번째 도전 시점의 혈청 Ct 평균은 43.72± 2.21이었으며, 안락사 시 검출 불가능한 ASF 표적 유전자 수준(45.00 ± 0.00)을 보였습니다(
그림 6b 및
표 S6). 첫 번째 도전 시점의 구강 면봉 CT 평균은 45.00 ± 0.00이었으며, 안락사 시 ASF 표적 유전자 수준(46 dpc)이 매우 낮았음(45.00 ± 0.00)으로 확인되었습니다(
그림 S3 및
표 S7). 직장 면봉 채취도 안락사 시 매우 낮은 수치(45.00 ± 0.00)를 보였다(
그림 S4 및
표 S8).
그림 6. (a) 이 그래프는 백신 접종 후 8주간의 챌린지 후 전혈에서 백신 관련 바이러스혈증이 나타난 것을 보여줍니다. 양성 임계값은 Ct ≤ 45입니다. 시간이 지남에 따라 백신 관련 바이러스증이 급격히 감소하는 것이 관찰됩니다. (b) 이 그래프는 백신 접종 및 챌린지 후 8주 후 다양한 시점에 채취된 혈청 샘플에서 관찰된 백신 관련 바이러스혈증을 보여줍니다. 양성 검출 기준은 Ct ≤ 45입니다. 백신 관련 바이러스혈증은 안락사 3-4주 전부터 모든 동물에서 검출 불가능한 수준으로 확인되었습니다.
T-3 그룹 (V9–V12): 87 DPV(첫 도전 시점)에서 평균 Ct값은 35.89 ± 5.36이었고, 안락사(21 dpc) 시점의 Ct 값은 39.33 ± 6.65였다(
그림 7a 및
표 S9). 예상대로, 첫 도전 시점에서 혈청 Ct 평균은 45.00± 0.00이었으며, 안락사 시점에서 ASF 표적 유전자 수준이 매우 낮았음(42.108 ± 5.01)이 확인되었습니다(
그림 7b 및
표 S10). 첫 번째 도전 시점에서 구강 면봉 CT 수치는 평균 45.00± 0.00이었으며, 안락사 시점에서 ASF 표적 유전자 수준(41.77 ± 3.23)이 매우 낮게 확인되었습니다(
그림 S5 및
표 S11). 직장 면봉 검사도 안락사 시 낮은 수치(43.85 ± 1.98)를 보였다(
그림 S6 및
표 S12).
그림 7. (a) 이 그래프는 백신 접종 후 12주 후의 챌린지 후 전혈에서 백신 관련 바이러스혈증을 보여줍니다. 양성 임계값은 Ct ≤ 45입니다. 시간이 지남에 따라 백신 관련 바이러스증은 급격히 감소했으며, 네 마리 중 두 마리가 음성 판정을 받았습니다. (b) 이 그래프는 백신 접종 후 12주 후 혈청 샘플에서 관찰된 백신 관련 바이러스혈증을 보여줍니다. 양성 검출 기준은 Ct ≤ 45입니다. 안락사 3주 전부터 백신 관련 바이러스증이 한 마리를 제외한 모든 동물에서 검출 불가능한 수준임이 확인되었습니다.
개별 동물 관찰: 백신 관련 바이러스혈증 결과와 관련해, 개체별 발견에는 동물 V-12에서 주목할 만한 관찰이 있었는데, 이들은 접종 후 38 dpv까지 전혈에서만 ASF 표적 유전자 검출을 보였습니다. 도전 후 또는 백신 접종 약 3개월 후 안락사 시점에서도 ASF 표적 유전자 검출은 이루어지지 않았습니다. 놀랍게도 V-12의 구강 및 직장 샘플 모두 연구 기간 내내 백신 접종 후 및 도전 후 단계까지 바이러스혈증이 나타나지 않아 이 동물을 연구 내 다른 동물들과 구별했습니다.
3.4. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 다중 및 지연 도전에 대한 혈청 사이토카인 평가
ASF 백신을 접종한 돼지와 ASFV 챌린지만 접종한 돼지의 혈청 샘플을 세포 면역 지표(IFN-γ 및 IL-12/IL-23 p40)와 항염증성 사이토카인 IL-1ra를 비교하여, 촉진염증성 사이토카인만보다 더 넓은 시각을 제공하였습니다. 참고로, 본 연구의 사이토카인 분석 결과는 표본 크기가 작아
p-값 기반 해석의 신뢰성이 제한되었습니다. 데이터는 통계적 유의성을 암시하기보다는 전체 추세와 변동성을 보여주기 위해 평균 ± 표준편차로 제시됩니다.
3.4.1. 백신 접종 후 혈청 사이토카인 반응
IFN-γ의 경우, 초기 접종 기간 동안 일부 동물에서 일시적인 증가가 관찰되었으나, 그러나 전체적으로 개체 간 변이가 상당했으며, 뚜렷한 일관된 고도 패턴은 나타나지 않았습니다. 또한, 백신 접종 후 기간 내내 그룹 간 유의미한 차이는 관찰되지 않았으며, 도전 접종 후 추가적인 상승 없이 유사한 패턴을 유지하였습니다(
그림 8).
그림 8. 인터페론(IFN)-γ ELISA. 초기 접종 단계에서 일부 개인에서 일시적인 증가가 관찰되었으나, 전반적인 일관된 상승 추세는 나타나지 않았습니다. 도전 이후에도 유사한 패턴이 지속되었으나 추가적인 증가는 없었다. DPV, 백신 접종 후 며칠 동안; DPC, 도전 후 며칠 만에.
For IL-12/IL-23 p40, the T-1 group showed initial elevation followed by gradual stabilization, with levels of 2921.7 ± 2057.8 pg/mL immediately post-vaccination, 2892.8 ± 1989.8 pg/mL at day 7, and 1790.9 ± 1269.7 pg/mL at day 14 (
Figure 9a). The T-2 group exhibited similar patterns, with levels of 2015.2 ± 1502.3 pg/mL immediately post-vaccination, 2517.2 ± 1566.2 pg/mL at day 7, and 1782.6 ± 1263.3 pg/mL at day 14 (
Figure 9b). The T-3 group also demonstrated initial elevation followed by stabilization, showing 2965.0 ± 992.0 pg/mL immediately post-vaccination, 3243.1 ± 2181.9 pg/mL at day 7, and 1764.0 ± 1127.6 pg/mL at day 14 (
Figure 9c).
그림 9. (a) IL-12/IL-23p40 엘리사. T-1군: IL-12/IL-23p40 반응은 접종 후 7–14일 이내에 초기 증가를 보였으며, 이후 점진적인 안정화 경향을 보였습니다. 반복적인 도전 백신 접종 후에도 IL-12/IL-23p40 반응 패턴은 크게 변하지 않았고 안정성을 유지했습니다. C-1 그룹: 도전 접종 후 7일 후에 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다. (b) IL-12/IL-23p40 엘리사. T-2 그룹: 백신 접종 8주 후 도전 그룹에서는 백신 접종 직후 7일째부터 14일째 초기 상승 후 점진적인 안정화 추세가 관찰되었습니다. 도전 후에도 유사한 경향이 뚜렷한 변화 없이 확인되었습니다. C-2 그룹: 도전 접종 후 7일째에 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다. (c) IL-12/IL-23p40 엘리사. T-3 그룹: 백신 접종 후 12주 시점에 도전받은 그룹은 접종 후 7일에서 14일로 초기 증가 추세를 보였으며, 이후 점진적으로 안정화되었습니다. 챌린지 이후에도 유사한 경향이 관찰되었으나, 유의미한 변화는 없었다. C-3 그룹: 도전 접종 후 7일째에 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다.
IL-1ra도 유사한 패턴을 보였습니다. T-1 그룹은 백신 접종 직후 2069.2 ± 875.4 pg/mL, 7일째 1635.4 ± 1191.9 pg/mL, 14일째 625.0 ± 411.3 pg/mL를 보였습니다(
그림 10a). T-2 그룹은 각각 1794.4 ± 549.2 pg/mL, 2165.0 ± 332.5 pg/mL, 400.3 ± 104.5 pg/mL를 보였다(
그림 10b). T-3 그룹은 초기 상승 후 안정화되어 백신 접종 직후 2367.3 ± 885.6 pg/mL, 7일째 2297.3 ± 1612.1 pg/mL, 14일째 814.8 ± 297.2 pg/mL 수치를 보였다(
그림 10c).
그림 10. (a) 인터루킨-1 수용체 길항제 (IL-1ra) ELISA. T-1군: IL-1ra 반응은 접종 후 7일에서 14일 사이에 초기 증가를 보였고, 이후 점진적으로 안정화 추세를 보였습니다. 반복적인 도전 백신 접종에도 불구하고 전체 IL-1ra 반응 패턴은 크게 변하지 않았고 안정을 유지했습니다. C-1 그룹: 도전 접종 후 7일 후에 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다. (b) 일-1라 엘리사. T-2 그룹: 백신 접종 8주 후 도전 대상군은 접종 직후 초기 상승을 보였고, 이후 점진적인 안정화 추세를 보였습니다. 도전 이후에도 유사한 경향이 관찰되었고, 큰 변화는 없었다. C-2 그룹: 도전 후 7일째 접종 후 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다. (c) 일-1라 엘리사. T-3 그룹: 백신 접종 후 12주 시점에 도전받은 그룹은 접종 직후 7일에서 14일로 초기 증가 추세를 보였으며, 이후 점진적으로 안정화되었습니다. 도전 후에는 유사한 안정화 추세가 관찰되었으나 유의미한 변화는 없었다. C-3 그룹: 도전 접종 후 7일째에 급격한 증가가 관찰되었습니다. 그 후 모든 대조군 동물이 사망했습니다.
3.4.2. 도전 후 혈청 사이토카인 반응
백신 접종 그룹(T-1, T-2, T-3)에서는 도전 접종 후 유의미한 추가 상승이 관찰되지 않았으며, 수치는 도전 전 패턴과 유사하게 유지되었습니다. 특히, T-1 그룹에서 반복적인 도전(1/2/3) 후에도 전체 사이토카인 반응 패턴은 크게 변하지 않았으며, 지연 도전군 T-2와 T-3과 유사한 경향을 보였다. 구체적으로, 1차, 2, 3차 도전 후 T-1군의 평균 IL-12/IL-23 p40 농도는 각각 2024.8 ± 1223.0 pg/mL, 1376.0 ± 582.3 pg/mL, 1392.3 ± 880.9 pg/mL였습니다(
그림 9a). T-2 및 T-3 그룹에서도 유사한 경향이 확인되었으며, 도전 후 수치는 각각 1295.2 ± 880.3 pg/mL, 612.3 ± 361.7 pg/mL로 변동이 미미했다(
그림 9b,c).
IL-1ra는 또한 백신 접종 그룹에서 도전 후 유의미한 추가 상승 없이 비교적 안정적인 패턴을 보였습니다. T-1군에서는 반복 도전 후에도 수치가 484.8 ± 226.5 pg/mL, 103.7 ± 153.5 pg/mL, 97.2 ± 194.5 pg/mL로 변함이 없었다(
그림 10a). T-2 및 T-3 그룹도 도전 전 조건과 유사한 수치를 유지했으며, 도전 후 수치는 각각 486.2 ± 264.0 pg/mL, 151.1 ± 278.1 pg/mL였습니다(
그림 10b 및
그림 10c).
반면, 대조군(C-1, C-2, C-3)은 도전 접종 후 IL-12/IL-23 p40과 IL-1ra가 빠르게 상승하는 경향이 있었다. 대표적으로 대조군의 IL-12/IL-23 p40은 도전 직전 1038.4 ± 439.2 pg/mL에서 도전 후 7일째에는 2836.0± 291.4 pg/mL로 증가
했으며,IL-1ra는 338.7 ± 290.3 pg/mL에서 1188.4 ± 69.9 pg/mL로 증가했습니다(
그림 10a–c). 이후 대조군 동물들은 사망률 추세를 보였고, 이 반응은 각 도전 시점에서 대조군에서 일관되게 확인되었습니다.
백신 접종군에서는 초기 접종 후 안정화 과정에서 IL-12/IL-23 p40과 IL-1ra의 제한적이고 통제된 상승 반응이 있었으며, 도전 접종 후 과도한 사이토카인 상승은 유도되지 않았습니다. 반대로 대조군은 도전 후 두 마커 모두가 급격히 상승하는 경향을 보였으며, 이는 치명적인 임상 진행과 관련된 패턴으로 해석되었습니다.
4. 토론
1921년 처음 발견된 이후 100년이 넘는 연구에도 불구하고, ASFV는 여전히 기존의 박멸 전략을 회피하는 강력한 도전 과제를 제시하고 있습니다. 예방접종을 통한 완전한 멸균 면역 달성은 여전히 달성하기 어려웠지만, 전 세계 돼지 산업에 미치는 지속적인 파괴적인 사회경제적 영향은 우리의 접근 방식에 실용적인 전환을 요구합니다. 식량 안보 문제를 시급히 해결해야 할 필요성을 감안할 때, 안전성이 검증된 LAV의 전략적 배치는 지역 풍토병 패턴과 국가 정책 틀에 따라 우선순위를 정해야 합니다. 이 접근법은 이상화된 보편적 백신 해결책을 추구하면서 중요한 개입을 지연시키는 것보다 현실적인 대안입니다.
따라서 ASF에 대한 안전하고 효과적인 백신 개발은 특히 아시아의 풍토병 지역에서 가장 중요한 도전 과제입니다. 이 지역에서는 소규모 가축 사육이 바이러스 압력이 높은 곳에서 공존하고 있습니다 [11,21,28,29]
.
이 연구는 이러한 고위험 환경을 모방하는 실험 조건에서 다중 유전자 결실 LAV 후보의 효능과 면역원성을 평가했으며, 특히 상동형 야생형 ASFV에 대한 반복적이고 지연된 노출에 중점을 두었습니다.
이 연구의 가장 주목할 만한 발견 중 하나는 엄격한 도전 프로토콜에도 불구하고 모든 접종자 그룹에서 100% 생존율과 임상 증상 부재로 입증된 완전한 보호 관찰이었습니다. 이전 연구들은 LAVs의 초기 보호 효과를 입증했지만[14,18,26
], 우리의
결과는 면역 반응이 세 차례 연속 도전 후에도 여전히 견고함을 확인시켜 이 결과를 확장시켰습니다.
이 '누적 바이러스 압력' 모델은 환경 오염, 차량 및 인력을 통한 기계적 전파, 감염된 뒷마당 농장과의 근접성으로 인해 돼지가 바이러스에 지속적으로 노출되는 풍토병 지역에 매우 관련성이 높습니다. 더욱이 백신 접종 후 8주와 12주에 실시된 지연 도전 검사는 백신 유도 면역이 급격히 감소하지 않는다는 것을 보여주어, 성장 중인 돼지에 대한 단일 백신 접종만으로도 시장 연령까지 ASF에 대한 보호를 제공할 수 있음을 시사합니다. 이는 장기 현장 적용에 필수적인 지속적인 보호 제공을 확인시켜 줍니다.
비록 실제 소규모 농장 환경에서의 전형적인 병원체 적재 현장 시험은 아니었지만, 모든 실험은 면역학적 간섭 가능성을 최소화한 조건에서 백신 효능을 검증하도록 설계된 조건에서 수행되었습니다.
LAV 이후 가장 큰 우려는 백신 바이러스 배출로, 이는 함께 사는 동물과 주변 환경에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 배출은 백신 유전자나 바이러스가 혈액, 구강 분비물, 대변 샘플에서 검출 가능한 상태로 남아 있을 수 있습니다. 특히, 이 연구에서는 백신 접종과 챌린지 후 바이러스 복제가 부분적으로 감소하는 점진적인 증거가 관찰되었습니다. 28일 간격으로 세 차례 연속 도전 검사를 받았음에도 불구하고, 4마리 동물 중 1마리의 전혈 샘플에서만 최소 수준의 백신 게놈이 검출되었고, 다른 모든 동물의 혈액, 구강, 대변 샘플에서는 검출되지 않았습니다. 이는 백신 유도 면역체계가 숙주 내 병원체의 생존과 복제를 효과적으로 방지하며, 이는 통제된 바이러스 잔류물의 특징으로 현장 적용에 추가적인 안전성을 제공함을 시사합니다.
반복적인 고용량 도전 시 바이러스 배출이 거의 없다는 점은 백신 접종 동물이 임상 질환에 저항할 뿐만 아니라 2차 전파 가능성도 제한한다는 것을 시사합니다. 이 이중 보호 메커니즘은 특히 백신 접종자와 미접종자 모두를 위협하는 풍토병 지역에서 인구 단위 질병 통제에 중요한 진전을 의미합니다.
부분적으로 감소한 바이러스 복제는 LAV가 형성한 면역 기억이 이후 바이러스 노출 시 신속한 중화에 충분히 강인함을 보여주며, 개별 동물 보호를 넘어선 광범위한 역학적 통제 가능성을 뒷받침합니다.
임상시험에서 발견된 주요 관찰 중 하나는 백신 게놈 검출과 항체 유지 간의 차이 패턴이었습니다. 대부분의 백신 접종 돼지들은 혈액 내 백신 유전체가 지속적으로 검출되고 항체 역가가 높았으나, 일부 개체는 백신 유전체가 완전히 제거되거나 크게 감소한 후에도 최대 4개월간 높은 항체 수치를 유지했습니다. 이는 LAV 균주의 초기 복제만으로도 장기 기억 T세포와 B세포 반응을 유도하기에 충분함을 시사합니다. 안전성 측면에서 보면, 숙주가 백신 바이러스를 제거하면서도 보호 면역을 유지하는 능력은 매우 바람직한 특성으로, 현장에서 만성 지속 위험이나 잠재적 병원성 역전 위험을 줄여줍니다.
이 강력한 보호 장치의 세포 메커니즘을 이해하기 위해, 주요 촉진염증 및 항염증 사이토카인의 프로필을 분석했습니다. 이전 보고서에 따르면, 보호된 돼지에서 IFN-γ 및 IL-12/23 p40 소단위체의 지속적인 수치는 강한 Th1 편향 세포 면역 반응을 나타냅니다. IL-12와 IL-23은 선천 면역과 적응 면역을 연결하는 데 중요한 역할을 하며, ASFV 복제를 억제하는 데 중요한 IFN-γ 생성 T 세포와 자연 살해 세포의 분화를 촉진합니다 [
22]. 사이토카인 반응의 높은 변동성으로 인해 면역 기전에 대한 명확한 결론을 내리기 어렵지만, 우리는 전체적인 추세를 다음과 같이 해석했습니다.
사이토카인 분석은 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보의 면역학적 안전성 프로필에 중요한 통찰을 제공합니다. 이 연구에서 관찰된 조절된 사이토카인 반응 패턴은 이 백신을 야생형 ASFV 감염과 명확히 구별하는데, 야생형 ASFV 감염은 통제되지 않은 사이토카인 폭풍과 출혈열을 특징으로 합니다.
지속적인 염증 반응 없이 일시적으로 IFN-γ 상승하는 것은 적절한 면역 활성화와 효과적인 조절을 나타냅니다. 마찬가지로, IL-12/IL-23 p40 패턴이 백신 접종 직후 최대 상승과 14일째 안정화되는 현상은 장기간 염증 없이 ASFV에 대한 세포 면역에 필수적인 대식세포 활성화가 통제됨을 나타냅니다.
중요하게도, 균형 잡힌 IL-1ra 발현은 이 백신 후보의 중요한 안전성 기전을 나타냅니다. IL-1ra는 염증성 IL-1β를 효과적으로 상쇄하여, 일반적으로 생백신에서 발생하는 과도한 전신 염증을 예방합니다. 이러한 조절 균형은 임상 부작용이 없고, 치명적인 ASFV의 치명적인 사이토카인 폭풍을 유발하지 않으면서 바이러스를 중화시키는 통제된 면역 환경을 만듭니다. 이 결과는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신이 효과적인 사이토카인 조절을 통해 안전성을 유지하면서 최적의 면역 활성화를 달성함을 보여주며, ASF 백신 후보로서의 가능성을 뒷받침합니다. 현재 이 백신 후보의 안전성을 추가 평가하기 위한 독성 회복 연구가 진행 중입니다. 이 결과는 유전적 안정성에 대한 중요한 통찰을 제공하며, 이를 입증함으로써 궁극적으로 백신의 전반적인 안전성 프로필을 검증할 것입니다.
더 나아가, 백신 바이러스 배출 관점에서 볼 때, 면봉 검사에서 관찰된 구강 및 대변 경로를 통한 백신 바이러스의 배설 통제는 이 백신 후보의 현장 적용 가능성을 더욱 뒷받침합니다. 소규모 농장에 흩어져 있어 생물보안이 최적이 약한 많은 아시아 국가에서, 광범위한 보호를 제공하면서도 탈모를 제한하는 백신이 필수 도구가 됩니다. 우리의 '반복 및 지연 재감염' 모델은 이 특정 지리적 맥락에서 백신의 내구성을 평가하는 전략적 평가 틀 역할을 합니다.
5. 결론
다중 유전자 결실 LAV 후보는 고강도 도전 모델에서 뛰어난 내구성과 안전성을 입증했습니다. 본 연구에 사용된 LAV는 면역학적 간섭 없이 백신 효능의 기준선을 확립하기 위해 통제된 조건 하에 선별된 병원체가 없는 동물에게 투여되었으며; 그러나 이러한 표준화된 실험 조건은 백신 특이적 면역 반응을 분리하고, 자연 병원체 노출이 포함된 더 복잡한 환경에서 향후 실시될 현장 시험의 기초가 될 기본 안전성 및 효능 지표를 확립하는 데 필수적이었습니다. 중요한 점은, 본 연구가 상동 도전 임상시험으로만 설계되어 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보가 상동 ASFV 균주에 대해 강력한 보호를 제공함을 입증했다는 것입니다; 이종 도전 실험은 이 연구에서 수행되거나 평가되지 않았습니다. 이 백신 후보는 초기 접종 단계에서 제한적이고 통제된 면역 반응을 유도하는 동시에 실제 바이러스 노출 시 대조군에서 관찰되는 치명적인 사이토카인 급증을 효과적으로 억제하여 생존율을 높였습니다. 이는 백신에 의해 유도된 면역 기억이 야생형 바이러스 복제를 억제하고 숙주 면역 체계를 조절하여 폭주 반응을 방지한다는 점을 강력히 뒷받침합니다. 따라서 본 연구에서 반복적이고 지연된 상동 도전 실험의 결과는 이 백신 후보의 지속적인 개발을 뒷받침하는 필수적인 기초 데이터를 제공합니다. 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 본 연구에는 몇 가지 한계점이 있음을 인정합니다: 작은 실험군 규모, 상동 바이러스의 독점 사용, 게놈 안정성 분석에 사용된 통로 수가 적음, 그리고 공동 감염 후 전체 게놈 시퀀싱이 수행되지 않았다는 점입니다. 향후 연구는 이러한 모든 한계를 다루어야 하며; 국제 지침에 따른 규제 심사 전에 더 큰 실험 코호트, 이종 균주 평가, 전체 유전체 시퀀싱과 함께 진행된 장기 연속 통과 임상시험, 현장 시험 등 추가 연구가 필요합니다.
보조 자료
다음 지원 정보는 다음
https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines14070561/s1, 표 S1–S4에서 다운로드할 수 있습니다: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-1 및 C-1의 샘플(전혈, 혈청, 구강, 직장)의 qPCR Ct 값을 요약합니다. 표 S5–S8: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-2 및 C-2의 샘플(전혈, 혈청, 구강, 직장 샘플)에 대한 qPCR Ct 값을 요약합니다. 표 S9–S12: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-3 및 C-3의 샘플(전혈, 혈청, 구강, 직장 샘플)에 대한 qPCR Ct 값을 요약합니다. 그림 S1 및 S2: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-1과 C-1의 구강 및 직장 샘플 qPCR Ct 값. 그림 S3 및 S4: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-2 및 C-2의 구강 및 직장 샘플에 대한 qPCR Ct 값. 그림 S5 및 S6: 백신 접종 및 도전 감염 후 실험군 T-3 및 C-3의 구강 및 직장 샘플 qPCR Ct 값.
저자 기여
개념화, J.H.S., W.J. 및 S.C.M.; 방법론 S.J.L.과 Y.K.; 형식 해석학, J.H.S., S.J.L. 및 S.A.C.; 조사, S.Y.L., X.Z., D.S.K., Y.K., S.J.L., S.A.C., S.P.S., W.K., Y.S., B.-C.S., S.C., J.-Y.S. 그리고 G.K.; 글쓰기—원고 준비, J.H.S.; 글쓰기—리뷰 및 편집, J.H.S., S.A.C. 및 S.P.S.; 감독, W.J.와 J.H.S. 모든 저자는 원고의 출판본을 읽고 동의했습니다.
자금 조달
이 연구는 Komipharm과 대한민국 기후에너지환경부 산하 국립야생동물질병통제연구소(NIWDC)의 지원을 받았습니다(NIWDC-2025-RP-06).
기관심사위원회 성명
야생동물 질병 통제 및 예방(NIWDC) 동물 시설에서 혈액, 구강 및 직장 면봉을 채취하는 동물 실험이 생물안전 레벨 3 조건 하에 수행되었습니다. 모든 동물 시술은 공화국 기후·에너지·환경부(MCEE) 산하 NIWDC 국립연구소 기관 동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 준수하여 수행되었습니다(프로토콜 NIWDC-IACUC-2025-002, 2025년 9월 1일 승인).
사전 동의서
해당되지 않습니다.
데이터 가용성 명세서
감사의 글
ASF 임상시험을 위한 ABSL-3 시설을 승인해 준 정부 관계자, 국립야생동물질병통제예방연구소(NIWDC), 기후에너지환경부(MCEE)에 감사드립니다.
이해 상충
이 연구는 Komipharm과 대한민국 기후에너지환경부 산하 국립야생동물질병통제연구소(NIWDC)의 지원을 받았습니다(NIWDC-2025-RP-06). 연구의 설계에는 자금 지원자들이 관여하지 않았으며; 데이터 수집, 분석 또는 해석에 관해; 원고 작성 과정에서; 또는 결과를 발표할지 결정하는 데 있어서도 말이다. 저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.
약어
이 원고에는 다음과 같은 약어가 사용되었다:
| ASFV | 아프리카 돼지열 바이러스 |
| LAV | 생백신 소감 백신 |
| 와우 | 세계동물보건기구 |
| 피펙 | 플럼 아일랜드 돼지 상피세포 |
| DPV | 백신 접종 후 며칠 |
| DPC | 도전 후 며칠 |
| WPV | 백신 접종 후 일주일 |
| IM | 근육 내 근육 |
| qPCR | 정량적 실시간 PCR |
| 가졌다 | 흡착 선량 |
| TCID | 조직 배양 감염 용량 |
| 엘리사 | 효소 결합 면역흡착 분석법 |
| CT | 사이클 임계값 |
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